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抗酸化作用測定法

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ルミカウンターによる抗酸化作用測定法

はじめに

呼吸で体内に取り込まれた酸素の約 3% は電子伝達系でのエネルギー代謝時に還元されスーパーオキシドアニオン(O2-)、過酸化水素(H2O2)、ヒドロ キシルラジカル(・OH)および一重項酸素(1O2)などの活性酸素に変わります。これらの活性酸素はたんぱく質を変成させたり、DNA の制癌遺伝子を破壊して癌化の原因となると指摘されています。

一方、人体には スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)などの活性酸素を消去する酵素やアスコルビン酸(ビタミンC)や α-トコフェノール(ビタミンE)等の抗酸化物質があり、これらの働きで体内の活性酸素は除去されます。近年、カテキン、イソフラボン等のポリフェノール類などの抗酸化力を持つ物質やその補助をとして働く物質の探索が注目されており、その能力の解析が進められています。ここでは抗酸化力測定法としてラジカル消去能を化学発光を用いて測定する方法をまとめました。


Fig.1 活性酸素の発生及び除去

原理

化学発光

化学発光は、発光基質の酸化により引き起こされます。ルミノールは鉄等の金属イオンや錯体を触媒とし、H2O2により酸化されて 3-アミノフタル酸ができます。このとき、まず励起一重項状態となり、これが基底状態になるときに青く発光します。

抗酸化力の評価

発光基質の目的物質による発光の酸化阻害を測定することで、目的物質の抗酸化能を測定することが可能です。抗酸化力の指標として酵素反応などを利用して発生させたラジカルに対するラジカル消去能を調べる方法があります。また、ESR(電子スピン共鳴)法などでは発生したラジカルをDMPOで捕らえ、それをラジカル強度として測定しています。そのため、間接的にスーパーオキシドの消去を追跡しているのですが、発光測定では直接活性酸素が開裂したときに生じる発光を測定しているので、より直接的な測定法といえます。

ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼの基質−酵素反応によって生じた活性酸素の一種であるO2-をルミノール、ルシゲニンル、またウミホタル・ルシフェリン誘導体などで発光させ、ルミカウンターで発光量を測定します。このとき抗酸化物質を未添加での発光量をA、添加したときの発光量をBとして阻害率(阻害率(%)=1−B/A×100)を算出します。この阻害率が高いほど抗酸化作用が高いと推測できます。また、 SODでの阻害率を基準として試料の単位重量当りの阻害率を SOD 相当量に換算することで定量的な測定が可能になります。


Fig.2 抗酸化作用測定原理

ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系での O2- 生成

抗酸化力の測定例

ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ反応よりO2- 生成し、発光試薬を用い発光させます。ここに試料として抗酸化物質を添加し阻害率を求めます。

■試薬

■測定

ルミカウンターを用いて測定を行います。高感度微弱光測定機ですので窓際などの直射光の入る場所を避け湿気に注意してください。NU-700ではマイクロチューブでの測定が可能です。またNU-2500ではさらに攪拌機能があり、一定間隔で反転し回転軸の中心を僅かにずらした攪拌装置によりサンプルを効果的に攪拌することができます。


Fig.3 ルミカウンター NU-2500

(A) 抗酸化物質 未添加マイクロチューブに

 

を分注し装置にセットします。Oxanthine 溶液を自動分注器より分注し一分間の発光積算値を測定します。

(B) 抗酸化物質 添加マイクロチューブに

を分注し装置にセットします。 Oxanthine 溶液を自動分注器より分注し一分間の発光積算値を測定します。

応用分野

抗酸化力測定及び活性酸素の測定は以下分野で用いられています。

またルミカウンターは活性酸素の測定以外にも以下のような様々な用途に用いることができます。


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